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以下是小鼠鈣調磷酸酶(CaN)ELISA試劑盒的實(shí)驗使用說(shuō)明書(shū)：
一、試劑盒概述
?用途?：用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中小鼠鈣調磷酸酶(CaN)的含量。
?產(chǎn)地與品牌?：不同品牌的試劑盒可能產(chǎn)自不同地方，例如天津本生或天正信達生物。
BS-9284小鼠鈣調磷酸酶(CaN)ELISA試劑盒
?包裝規格?：通常有48T和96T兩種規格。
?保存條件?：2~8℃保存。
?有效期?：一般為6個(gè)月，具體以說(shuō)明書(shū)為準。
二、實(shí)驗原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被小鼠鈣調磷酸酶(CaN)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過(guò)溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠鈣調磷酸酶(CaN)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長(cháng)下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度。
三、樣本處理及要求
?血清?：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后1000×g離心20分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
?血漿?：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2~8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
?組織勻漿?：用預冷的PBS(0.01M，pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會(huì )影響測量結果)，稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實(shí)驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
?細胞培養物上清或其它生物標本?：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
四、試劑盒組成
試劑盒通常包含以下組件(具體以說(shuō)明書(shū)為準)：
微孔酶標板
標準品
樣本稀釋液
檢測抗體-HRP
20×洗滌緩沖液
底物A、B
終止液
封板膜
說(shuō)明書(shū)
自封袋
其他可能包含的配件(如空白稀釋板、橡膠手套等)
五、操作步驟
從室溫平衡20分鐘后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL。
樣本孔中加入待測樣本50μL;空白孔不加。
除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60分鐘。
棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液(350μL)，靜置1分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。
每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15分鐘。
每孔加入終止液50μL，混勻后在30分鐘內用酶標儀在450nm處測定各孔的OD值。
六、注意事項
所有OD值建議減除空白值后再行計算，如空白OD低于0.1，也可以直接計算。
以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，手工繪制或用軟件繪制標準曲線(xiàn)，根據樣品OD值計算出相應含量，再乘上稀釋倍數即可。
在試驗中標準品和樣本檢測時(shí)建議作雙孔檢測，每次檢測都應做標準曲線(xiàn)。
洗滌過(guò)程很關(guān)鍵，洗滌不充分將導致精確度誤差及OD值錯誤地升高。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正?，F象，37℃水浴使結晶溶解后再配制洗滌液。
檢測時(shí)所有試劑都要恢復到室溫，板條開(kāi)封后剩余板條需封好，放回袋中2個(gè)月內用完。
試劑盒使用超敏TMB溶液，若顯色過(guò)深會(huì )出現絮狀物，屬正?，F象，不影響結果判讀。
僅用于科研，不能用于臨床診斷。
請按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以確保實(shí)驗結果的準確性。不同品牌的試劑盒在具體操作步驟和試劑組成上可能有所差異，因此在使用前務(wù)必仔細閱讀并遵循相應品牌的說(shuō)明書(shū)。
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