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大鼠DNA甲基化轉移酶(DNMT)ELISA試劑盒的實(shí)驗使用說(shuō)明書(shū)通常包含以下內容,但請注意,具體說(shuō)明可能因不同制造商和試劑盒版本而有所差異。以下是一個(gè)基于通用標準的概述:
BS-8543 大鼠DNA甲基化轉移酶(DNMT)ELISA試劑盒
一、產(chǎn)品概述
?用途?:本試劑盒用于測定大鼠血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中DNA甲基化轉移酶(DNMT)的含量,僅供研究使用。
二、實(shí)驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠DNA甲基化轉移酶(DNMT)水平。用純化的大鼠DNA甲基化轉移酶(DNMT)捕獲抗體包被微孔板,制成固相抗體。往包被的微孔中依次加入大鼠DNA甲基化轉移酶(DNMT),再與HRP標記的檢測抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物。經(jīng)過(guò)洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠DNA甲基化轉移酶(DNMT)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長(cháng)下測定吸光度(OD值),通過(guò)標準曲線(xiàn)計算樣品中大鼠DNA甲基化轉移酶(DNMT)含量。
三、試劑盒組成
試劑盒通常包含酶標包被板、標準品、酶標試劑、樣品稀釋液、顯色劑A液、顯色劑B液、終止液、濃縮洗滌液等組件,具體數量和配置可能因試劑盒規格(如48孔或96孔)而異。
四、樣本采集與處理
?血清?:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。
?血漿?:應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。
?尿液?:用無(wú)菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清,保存過(guò)程中如有沉淀形成,應再次離心。
?細胞培養上清?:檢測分泌性的成份時(shí),用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時(shí),用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復凍融,以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。
?組織標本?:切割標本后,稱(chēng)取重量。加入一定量的PBS(PH7.4)。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。
標本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻進(jìn)行,提取后應盡快進(jìn)行實(shí)驗。若不能馬上進(jìn)行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融。
五、實(shí)驗步驟
?標準品的加樣?:設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品。
?加樣?:在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液,然后再加待測樣品。加樣時(shí)將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。
?加酶?:每孔加入酶標試劑(空白孔除外)。
?溫育?:用封板膜封板后置37℃溫育一定時(shí)間。
?配液?:將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋后備用。
?洗滌?:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿(mǎn)洗滌液,靜置后棄去,重復多次,拍干。
?顯色?:每孔加入顯色劑A和B,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色。
?終止?:每孔加終止液,終止反應。
?測定?:以空白孔調零,在450nm波長(cháng)依序測量各孔的吸光度(OD值)。
六、注意事項
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡一段時(shí)間后方可使用。
濃洗滌液可能會(huì )有結晶析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。
各步加樣均應使用加樣器,并經(jīng)常校對其準確性。
封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
底物應避光保存。
嚴格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準。
七、性能與保存
?性能?:樣品線(xiàn)性回歸與預期濃度相關(guān)系數R值通常高于0.95,批內變異系數與批間變異系數應分別小于10%和15%。
?保存?:試劑盒應保存在2-8℃,有效期通常為6個(gè)月。
請注意,以上信息為通用標準概述,具體實(shí)驗時(shí)應嚴格遵循所使用試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
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